燕窝酸分离纯化与制备研究开题报告

1.1 研究背景

1.1.1 燕窝（燕碎）的简介

燕窝是雨燕科几种金丝燕分泌的唾液及其绒羽混合粘结所筑成的巢穴，主要产于马来西亚、印度尼西亚、泰国和缅甸等东南亚国家以及我国的福建等沿海地带。燕窝中含有丰富的糖类、有机酸、游离氨基酸以及特征物质——燕窝酸，因此，它广受人们喜爱。元代开始，中国就有了燕窝贸易，在清代的时候，其规模愈发扩大。到今天，中国仍然是世界上燕窝消费的主要国家之一。然而燕窝企业在加工、储藏和运输过程中发生碰撞，容易产生碎末,这就对原料的利用率造成了一定的限制。这时，研究燕碎就十分必要了。

1.1.2 燕窝（燕碎）的精华——燕窝酸（唾液酸）

唾液酸(SialicAcid)是一系列含有氨基的九碳单糖衍生物,它是所有神经氨酸及其衍生物的总称。但在人体当中只有一种,即N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminicacid, Neu5Ac),它就是广为人知的“燕窝酸”。最初的时候，燕窝酸是由牛颌下腺粘蛋白中分离得到的,因此也可以叫做唾液酸。它通常以低聚糖,糖脂或者糖蛋白的形式存在,主要以短链残基的形式存在于糖蛋白和糖脂的末端。

唾液酸在自然界中的分布十分广阔,它被人发现存在于许多生物体内,如脊椎动物、哺乳动物,尤其是在脑脊液和黏液中发现最多。唾液酸的最主要来源是母乳和奶制品，包括人乳、牛奶、羊奶、酸奶、奶酪等,母乳初乳中的含量最高，在1.5g/L左右，一般婴幼儿奶粉中添加的乳清蛋白含有唾液酸糖蛋白，其唾液酸含量平均为172mg/100g。唾液酸的另一个重要来源是蛋类食品。在蛋清中唾液酸的含量在0.2-0.3%。燕窝是家喻户晓的营养补品，在燕窝中，唾液酸的含量可达10%左右。

人们食用含唾液酸的食品有着悠久的历史。早在唐朝，我国已将燕窝作为食用珍品；明朝李时珍在《本草纲目拾遗》中称:燕窝味甘淡平，大养肺阴，化痰止咳补而能清为调理虚损劳瘵之圣品。

1.1.3 唾液酸的发展前景

燕窝酸在市场上的应用：

1、婴儿配方食品:许多著名全球婴儿配方制造商宣称在其配方奶粉中添加唾液酸(N-乙酰神经氨酸)。然而，大多数婴幼儿配方产品中的唾液酸含量是目前源自乳清粉而不是纯唾液酸。可以预期的是当唾液酸生产费用降低到一定水平的时候唾液酸会逐步替代乳清粉。

2、食品添加剂和营养补充剂:可以在糖果中添加唾液酸作为营养补充剂，可是因为它从燕窝中提取，价格比较昂贵，因此糖果不能定价为正常的棒棒糖。

3、抗流感病毒：含有唾液酸的口香糖可以是一个好的创意应付流感手节病毒。

4、化妆品:日本已开发含唾液酸的软育和喷雾剂保持头发健康生长。由于最近的研究发现的睡液酸拥有的抗氧化作用可以合理地添加入化妆品例如面部乳液和面膜内，同样给唾液酸带来巨大的潜在市场。

最新研究发现，燕窝酸可抗急性脑缺血，燕窝提取物可调节肠道菌群、改善肠道免疫损伤、预防胰岛素抵抗、抗氧化、抗H5N1禽流感病毒、可提高记忆力、降血压、促进子宫修复等。

综上所述，唾液酸市场应用前景广阔，唾液酸的大力推广会给社会和企业带来巨大的社会效益和经济效益。

1.1.4燕窝酸的研究方法及分离纯化

建立燕窝中唾液酸的柱前衍生二极管阵列/荧光检测器 (DAD/FLD) 串联的反相高效液相色谱检测方法。用硫酸氢钠溶液水解样品, 以邻苯二氨盐酸盐为衍生化试剂, 采用C18柱分离, 四氢呋喃溶液(含体积分数0.5%磷酸和体积分数0.15%正丁胺) -乙腈为流动相洗脱, 流速1.0mL/min, 荧光激发波长 (Ex) 230nm, 发射波长(Em) 425nm。本方法具有灵敏度高, 重复性好, 分析速度快等特点, 可准确测定燕窝等样品中唾液酸含量。

唾液酸提取后，纯度一般较低，为了更好地对其进行性质及生理功能等方面的研究，还需要经过进一步分离纯化后才能得到纯度较高的唾液酸产品。目前，常见的有关唾液酸提取液分离纯化的方法主要有乙醇沉淀除蛋白法、超滤法、溶析结晶法和离子交换层析法。超滤是以压力差为推动力，根据被分离物质分子大小差异进行分离的过程，可获得较高的蛋白质去除率。离子交换层析法是根据唾液酸和其他杂质与离子交换树脂结合能力的不同来实现分离纯化的。离子交换层析法分离能力强，所得唾液酸回收率高且唾液酸在此过程中性质稳定，不易发生改变。

1.1.5 研究目的

本论文以燕窝提取液为实验材料，利用HPLC及分光光度法测定其中燕窝酸含量，对燕窝酸提取液进行膜分离、柱层析分离纯化，并对所得的燕窝酸纯化品的主要成分及含量进行测定，以期为燕窝酸的开发利用提供科学依据。

2.1 主要研究内容

（1）燕窝酸提取液制备及HPLC及分光光度法测定燕窝酸含量；

（2）利用膜分离法分离纯化燕窝酸；

（3）利用柱层析法分离纯化燕窝酸；

（4）对分离纯化得到的燕窝酸纯化物的主要成分进行测定分析，测定燕窝酸纯度；

2.2 内容要求

论文包括目录、中英文摘要、关键词、前言、材料方法、结果、结论、参考文献等。

字数要求:不少于15000字;

文献查阅:参考文献不少于15篇( 包括部分英文文献)，翻译-篇5000字以上的相关英文文献。

其他要求:参照《苏州科技大学本科团队毕业设计( 论文)工作规范》、《苏州科技大学本科毕业设计(论文)工作条例(修订)》和《苏州科技大学化学生物与材料工程学院毕业设计(论文)工作细则》执行。

2.3 预期目标

（1）、获取燕窝酸标准液以及提取液，通过HPLC绘制燕窝酸浓度标准曲线以及样品中燕窝酸含量。

（2）、利用反渗透装置对燕窝酸提取液进行初步分离纯化（主要去除蛋白质），并测定透过液中燕窝酸含量和浓缩液中蛋白质含量。

（3）、利用柱层析装置对燕窝酸提取液进行第二次分离纯化(主要去除柠檬酸)，并测定柠檬酸去除率和唾液酸回收率。

（4）、冻干分离纯化后的提取液，得到游离态唾液酸样品，计算纯度。

3.1 燕窝酸提取液制备及HPLC法测定燕窝酸含量

（1）制备燕窝酸提取液

（2）唾液酸标准溶液配制：精确称取 0.1000 g N-乙酰神经氨酸标准品，配制成 1 00μg/mL的标准品储备液。取标准品储备液稀释成 0，20，40，60，80，100μg/mL 等浓度的标准品使用液，待衍生。(注：样品稀释用流动相稀释)

衍生条件：取样品溶液 1 mL，加入 20 mg/mL 的邻苯二氨盐酸盐溶液 1 mL，80℃避光水浴 40 min，取出迅速冷却后，经 0.45 μm 水系微孔滤膜过滤，准备进样。

（注：衍生条件可换成紫外分光光度计法测量时的条件：取1ml样液，加入1ml冰醋酸及1ml茚三酮溶液，100℃水浴10分钟，待其速冷后经 0.45 μm 水系微孔滤膜过滤，准备进样。）

色谱条件：色谱柱，流动相：1.0%四氢呋喃水溶液（含 0.5%磷酸、0.15%正丁胺）-乙腈（95:5,v/v）；荧光激发波长230 nm，发射波长 470nm；柱温：35℃；流速：0.3 mL/min；进样体积：60μL。

（3）绘制燕窝酸标准液标准曲线，并测定样品的燕窝酸含量。

3.2 利用膜分离法分离纯化燕窝酸

（1）唾液酸提取：用0.025mol/L、0.05mol/L、0.10mol/L、0.15mol/L、0.02mol/L的柠檬酸提取唾液酸

（2）利用3kDa反渗透膜，在40psi操作压力

（3）利用HPLC测得透过液唾液酸含量

（4）利用凯氏定氮法测得蛋白质含量/利用紫外分光光度法测定蛋白质含量

（5）计算唾液酸透过率以及蛋白质去除率。

3.3 利用柱层析法分离纯化燕窝酸

（1）柠檬酸的测定：HPLC法，

色谱条件:紫外检测器: 210 nm;色谱柱: C18；柱温: 30°C:流动相: 0.05%磷酸水溶液-甲醇(95:5, v/v);流速: 0.3 mL/min;进样体积: 60μL。

（2）树脂预处理：取阴离子交换树脂适量，用去离子水洗至无浑浊后，用足够多的去离子水浸泡24h，以约2倍体积的95%乙醇浸泡4h后，重复数次至在浸泡液中加入去离子水无浑浊产生后,用去离子水洗至无乙醇味。加入约2倍体积的Imol/LHCI溶液浸泡4h后，水洗至中性，再用约2倍体积的I mol/L NaOH溶液浸泡4h，并水洗至中性。以酸洗-水洗-碱洗-水洗为个循环，连续重复三次。预处理完后的树脂浸泡在去离子水中待用。

（3）选用D301阴离子交换树脂（柠檬酸吸附率和唾液酸保留率两方面考虑）；柠檬酸浓度，上样流速；最大上样量。

（4）柠檬酸的回收：采用0.5mol/L的NaOH溶液进行动态洗脱，再用001*14型阳离子进行转型后，计算柠檬酸回收率。

（5）计算唾液酸收率。

3.4对分离纯化的燕窝酸纯化物的主要成分进行测定分析以及测定燕窝酸纯度

（1）将纯化后的唾液酸提取液浓缩，冷冻干燥，取冻干粉末进行唾液酸纯度及基本成分的测定。

（2）测定唾液酸含量（HPLC法），测定柠檬酸含量（HPLC法），水分的测定（直接干燥法，参照国标GB/T5009.3-2010）,灰分的测定（直接灼烧法，参照国标GB/T5009.4-2010）,蛋白质的测定（凯氏定氮法），总糖的测定（苯酚-硫酸法）

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1、第17周（20-21-1学期）-第2周（2022年12月28日--2022年3月14日）接受任务、查阅和翻译文献、撰写及完成开题报告

2、第3周（2022年3月15日--2022年3月21日） 获取燕窝酸标准液以及提取液，通过HPLC绘制燕窝酸浓度标准曲线以及样品中燕窝酸含量。

3、第4周-第7周（2022年3月22日--2022年4月18 日）利用反渗透装置对燕窝酸提取液进行初步分离纯化（主要去除蛋白质），并测定透过液中燕窝酸含量和浓缩液中蛋白质含量。

4、第8-11周（2022年4月19日--2022年5月16日）利用柱层析装置对燕窝酸提取液进行第二次分离纯化(主要去除柠檬酸)，并测定柠檬酸去除率和唾液酸回收率。

5、第12周-第13周（2022年5月17日--2022年5月28日）将分离纯化后的提取液冻干，得游离态唾液酸样品，计算纯度。

6、第14周-第15周（2022年5月29日—2022年6月9日）分析数据，撰写毕业论文、答辩PPT。