5%葡萄糖注射液中微生物生产繁殖情况研究开题报告

1. 研究目的与意义

1.1 研究背景

1.1.1 无菌药品与gmp

药品生产质量管理规范认证，也被称为gmp认证，是国家用来监督和检查药品生产企业生产经营活动的制度和手段。无菌药品作为要求最为严格的制药项目，也必须经过gmp认证后才能生产和销售。

药品广泛的应用于公共卫生服务，其质量对人体健康有着非常突出的影响，因此关注药品生产的质量十分的必要。 近年来，在人们质量意识变化和企业发展改革的需求中，无菌药品企业强制实施新版的 gmp 要求，新版的 gmp 要求几乎与欧盟 gmp 标准接轨，所以要求企业在生产的过程中不仅要实现洁净级别的提高，更要在生产质量管理方面进行提升。《药品卫生标准》、《中药饮片炮制规范》以及《中华人民共和国药典》,这几部标准即为我国主要的法定药品标准。这些标准明确指定需要进行无菌项目检查的制剂和原料药就是无菌药品。简单来说，只要药品中不含有活体的微生物，即可被认为是无菌药品。

2. 研究内容和预期目标

2.1 本论文主要研究内容

（1）实验用标准菌株的制备与复苏

（2）实验用培养基、缓冲液的配制、灭菌、适用性及其无菌检查

3. 研究的方法与步骤

3.1 标准菌株制备

对实验选取的五种标准菌株分别制备甘油冻存管、斜面菌种、工作用传代菌株（复苏）制备，以备接种使用。

1.甘油冻存管

a)大肠埃希菌、金黄色葡存管萄球菌、铜绿假单胞菌甘油冻存管制备

b) 巴西曲霉甘油冻制备

c)白色念珠菌甘油冻存管制备

2.斜面菌种制备

a) 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌斜面制备

b) 白色念珠菌斜面制备

c) 巴西曲霉斜面制备

3 工作用菌株传代

a) 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌工作用菌株传代

b) 白色念珠菌工作用菌株传代

e) 巴西曲霉工作用菌株传代

3.2 检验用培养基及缓冲液制备

配制实验用所需培养基及缓冲液，选择以下灭菌流程进行灭菌，以备实验用。

3.2.1培养基灭菌方法

3.2.2培养基配制

配制以下几种实验用培养基及缓冲液

a）胰酪大豆陈液体培养基(TSB)；b）胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）；c)沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)；d)沙氏葡萄糖液体培养基(SDB)；e)0.9%无菌氯化钠溶液；f)含0.05%吐温80的0.9%氯化钠溶液；g)pH7.0氯化钠-蛋白陈缓冲液

注意：配制的培养基应分装后立即按验证合格的灭菌程序灭菌，避免细菌繁殖。若因意外无法立即灭菌，应先存放于阴凉处，若搁置时间超过2个小时，则该批培养基不可再用，应废弃处理。同批次配制培养基应为同灭菌批次，不得分次灭菌，培养基灭菌后不得贮藏在灭菌器中。

3.3 培养基的适用性检查

对实验用计数用培养基、控制菌检查用培养基进行适用性检查

3.4 无菌性检查

应对所用培养基、缓冲液进行无菌检查，判断是否符合无菌要求。无菌检查应在无菌条件下进行，验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供品中微生物的检出。

检查方法：薄膜过滤法、直接接种法

3.5微生物计数方法适用性验证

各试验菌的回收比值均在 0.5～2 范围内，阴性对照组无菌生长，说明方法可行

3.6 控制菌检查

控制菌检查适用性验证试验结果 采用不同的方法及培养基（TSB）的体积，在大肠埃希菌、金黄 色葡萄球菌和铜绿假单胞菌检查的方法适用性验证试验中，试验组能够检出所加试验菌相应反应特征，阴性对照均无菌生长，说明方法可行

3.7微生物限度检验流程

3.7.1 考察指标

贮存条件

室温：药液配制完成后，放置在实验室。

冷藏：药液配制完成后，放置在2-8℃冰箱里。

考察时间

检验用微生物

a) 标准菌株

金黄色葡萄球菌ATCC 6538

大肠埃希菌ATCC 8739

铜绿假单胞菌 ATCC 9027

白色念珠菌 ATCC 10231

巴西曲霉 ATCC 16404

b) 医院配药房的环境代表微生物

不动杆菌属：东曜内部菌株库菌株，菌种编号：2019091701

c) 人表面代表微生物

表皮葡萄球菌：东曜内部菌株库菌株，菌种编号：2019050501

3.7.2实验用菌悬液制备

取3.1中制备的标准菌株，按以下方法稀释制备实验用菌悬液

a) 取经30～35℃培养18～24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌的新鲜培养物1mL用0.9%氯化钠注射液对菌悬液进行梯度稀释，稀释至不超过10000cfu/mL，备用。

b) 取经30～35℃培养24-48小时的不动杆菌属的新鲜培养物1mL用0.9%氯化钠注射液对菌悬液进行梯度稀释，稀释至不超过10000cfu/mL，备用。

c) 取经20～25℃培养48-72小时的白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9%氯化钠注射液对菌悬液进行梯度稀释，稀释至不超过10000 cfu/mL，备用。

取经20～25℃培养5～7天的黑曲霉斜面培养物，用10mL含0.05%吐温80的0.9%氯化钠溶液，将黑曲霉孢子洗脱，收集孢子悬液，取1mL孢子悬液，用含0.05%吐温80的0.9%氯化钠溶液进行梯度稀释；稀释至不超过10000 cfu/mL，备用。

3.7.3试验组配制液制备

在生物安全柜下，用无菌注射器吸取备好的菌悬液注入到5%葡萄糖注射液中，注射量为1mL 菌悬液每100mL注射液，具体组别见下表

3.7.4阴性对照组配制液制备

生生物安全柜下，不加入菌悬液，考察100mL5%葡萄糖注射液，具体组别见下表

贮存：制备好各试液，用无菌呼吸袋包裹好，室温放置于微生物准备室，冷藏放置于2-8℃冰箱

3.7.5检验流程

按3.7.3及3.7.4的方法分为试验组和阴性对照组进行培养，设置试验组和阴性对照组，依考察时限要求，每个时间点取样进行微生物限度检查。

试验组培养的细菌取出滤膜，贴于TSA表面，霉菌、酵母菌取出滤膜贴于SDA表面。阴性对照组供试品TSA、 SDA 各制备一张膜。试验组：TSA30-35℃培养不超过3天，SDA20-25℃培养不超过5天；阴性对照组：TSA30-35℃培养3天，SDA20-25℃培养5天；

阴性对照组各时间点应无菌生长，试验方有效；

计算试验组各时间点每1mL的含菌量的lg值，与0h的lg值相比，增加不超过0.5，判定该时间点该类型的微生物没有明显增长。与0h的lg值相比，增加超过0.5，判定该时间点该类型的微生物有明显增长。

制备不同条件下不同菌种的繁殖曲线，对其稳定性进行考察、分析。

4. 参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典[s].2020 版.二部.北京: 中国医药科技出版社,2020: 1261-1262．

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典临床用药须知(化学药和生物制品卷) [m]．2015 版.北京: 中国医药科技出版社，2017: 863．

5. 计划与进度安排

1.第17周（20-21-1学期）-第2周（2022年12月28日--2022年3月14日）接受任务、查阅和翻译文献、撰写及完成开题报告

2、第3周（2022年3月15日--2022年3月21日） 葡萄糖注射液及标准菌株材料准备与处理；标准菌株制备

3、第4周-第7周（2022年3月22日--2022年4月18 日）实验用培养基制备；供试品的微生物计数方法和控制菌检查方法进行适用性验证