三唑类杀菌剂的富集及检测方法研究开题报告

1．本课题研究的背景、目的及意义

在世界范围内75%的蜂蜜中发现了存在对蜜蜂有害的杀虫剂的痕迹，而且是神经毒气的杀虫剂。因此，使人们对于这些关键作物的传粉者的生存状况更加担忧。全球198种类型的蜂蜜抽样检测发现有杀虫剂的存在，尽管其浓度低于欧盟授权供人类食用的标准，相关研究结果已经在《科学》杂志上发表。然而,该研究发现,34%的蜂蜜样品被烟碱类（neonicotinoids）物质所污染，其“浓度已知是对蜜蜂有害的”,研究者并警告说,长期接触是对蜜蜂生存的一种威胁。

蜜蜂帮助世界上90%的主要农作物授粉,但近年来因为“蜂群崩溃综合症（colony collapse disorder）”使蜜蜂的生存状况令人担忧。蜂群崩溃综合症是一种神秘的灾难，归咎于螨虫（mites）,杀虫剂（pesticides）、病毒（virus）、真菌（fungus）,或这些因素的组合。

三唑类杀菌剂的抑菌特点是在植物体内抑制病菌的附着胞、吸器的正常发育，使菌丝生长、孢子的形成受阻。因此，此类杀菌剂对几乎所有的真菌性病害有效，但对卵菌类病原菌无效，因卵菌类病菌的菌丝体无隔膜，不能使它受抑制。

三唑类杀菌剂为有机杂环类化合物，化学结构上共同特点是主链上含有羟基(酮基)、取代苯基和1，2，4-三唑基团化合物。三唑类杀菌剂具有高效、广谱、低残留、持效期长、内吸性强等特点，兼具保护、治疗、铲除和熏蒸作用。

三唑类杀菌剂就有很强的内吸传导性，喷施药液在作物上，很快即被吸收，一般经2小时，作物吸收的药量已能抑制白粉病菌的生长。植物的根能吸收三唑酮、三唑醇等并向上传导到地上部分，利用这一特点，三唑类药剂常用作种衣剂。叶面喷施后，可从已受药部位向叶尖端输导，叶鞘受药，能向叶部输导。但是叶尖受药向下输导则很少。输导仅限于在同一张叶片，不能转移到其他叶片。

蜂蜜中元素含量检测的时候,蜂蜜基质具有水溶性的特点,目前蜂蜜检测前处理方法包含微波消解法和压力罐等方式, 微波消解法加热快、升温高，消解能力强，大大缩短了溶样时间。消耗溶剂少，空白位低，消耗政溶剂少，空白位低。

2、主要研究内容：

1·三唑类杀菌剂为有机杂环类化合物，化学结构上共同特点是主链上含有羟基(酮基)、取代苯基和1，2，4-三唑基团化合物。三唑类杀菌剂具有高效、广谱、低残留、持效期长、内吸性强等特点，兼具保护、治疗、铲除和熏蒸作用。

“检测到的杀虫剂水平是足以影响蜜蜂大脑功能,可能会阻碍它们寻花采蜜的能力和植物授粉能力,其中重点包括农作物和天然植物的授粉。”

2·蜂蜜中的三唑类杀菌剂含量影响因素，在温、湿度适宜的条件下，蜂蜜中的酵母菌容易生长，使蜂蜜发酵变质；蜜蜂养殖过程中，蜂场手表可能存在粪池、臭水沟等污染源，蜂蜜到这些场所喝水，有可能携带大肠杆菌，从而影响蜂蜜质量安全；贮存、运输、销售等环境不卫生，蜂蜜收到微生物污染，在一定的温度和湿度条件下，蜂蜜中会出现微生物大量繁殖的现象。

3、预期目标：

本课题预期目标：

1）确定最合适的离子液体、萃取条件（温度、时间）、蜂蜜体积、pH 等因

素。

2）确定色谱柱、色谱条件和流动性梯度等色谱条件。

3）利于高效液相色谱法测定蜂蜜中的三唑类杀菌剂含量。

4、本课题拟采用的研究方法、步骤

研究方法

3.1.1 离子液体微萃取-高效液相色谱法

3.1.2 主要试剂

①溴化 1-丁基-3-甲基咪唑（纯度 99%）

②溴化 1-乙基-3-甲基咪唑（纯度 99%）

③溴化 1-辛基-3-甲基咪唑（纯度 99%）

④甲醇（色谱纯）

⑤氨水（分析纯 25%-28%）

3.1.3 主要仪器

①岛津高效液相色谱仪（美国 Agilent HP1100）

②Uwave-2000 多功能微波合成萃取仪（上海新怡微波化学科技有限公司）

③SK-1 快速混匀器（科学仪器有限公司）

④KQ-500E 超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）

⑤TGL-16C 台式离心机（上海安亭科学仪器厂）

3.2 实验步骤

1）样品处理

1、量取 20ml 的蜂蜜于 50ml 烧杯中，加入 5mg/l 混标的三唑类杀菌剂 100μl，

使其充分并均匀富集在蜂蜜中，用氨水调节其 pH 保持在 8.0 左右。

2、分别移取 1ml 的蜂蜜于 5ml 的塑料离心管中，每个离心管加入不同种类的

离子液体 80μl，然后加入磁子，进行微波萃取。

3、控制微波萃取条件为 3 分钟，40℃，使其离子液体完全打碎成为雾状，微波

萃取结束后，放入冷冻 5min。

4、冷冻完成后取出离心管，放入离心机 10000r/min进行离心 5min，待离子液

体和油分层后，定量移取下层离子液体。

5、加入甲醇定容至 300μL，充分混匀后过滤进行分析。

2）条件优化

1、离子液体体积的影响

选择最佳离子液体后，分别在不同含有黄曲霉毒素的蜂蜜离心管中滴加 60、

70、80、90、100ul 的离子液体，控制萃取温度和时间、蜂蜜体积和 pH 不变

的条件下进行萃取，完成后用甲醇定容至 300μL 后过滤进行分析，根据回收率

确定最佳离子液体体积。

2、萃取时间的影响

选择最佳离子液体和离子液体的体积，改变萃取时间分别为 3、5、7、9、

11min，控制萃取温度、蜂蜜体积和 pH 不变的条件下进行萃取，完成后用甲

醇定容至 300μL 后过滤进行分析，根据回收率确定最佳萃取时间。

3、萃取温度的影响

选择最佳离子液体、离子液体的体积和萃取时间，改变萃取温度分别为 20、

30、40、50、60℃，控制蜂蜜体积和 pH 不变的条件下进行萃取，完成后用甲

醇定容至 300μL 后过滤进行分析，根据回收率确定最佳萃取温度。

4、蜂蜜体积的影响

选择最佳离子液体、离子液体的体积、萃取时间和温度，改变蜂蜜体积分别

为 0.5、1、2、3、5ml，控制 pH 不变的条件下进行萃取，完成后用甲醇定容至

300μL 后过滤进行分析，根据回收率确定最佳蜂蜜体积。

5、溶液 pH 的影响

选择最佳离子液体、离子液体的体积、萃取时间、萃取温度和蜂蜜体积，改

变 pH 分别为 6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，进行萃取，完成后用甲醇定容至 300μL

后过滤进行分析，根据回收率确定最佳 pH。