茶多酚微乳剂对圣女果青霉菌的抑制及保鲜效果研究开题报告

3．本课题拟采用的研究方法、步骤

1、微乳剂制备

室温下, 将茶多酚粉末分别与几种助溶剂混合,找出溶解性较好的几种，用同一种乳化剂分别滴定，对滴定结果做拟三元相图，比较图中微乳区大小选出最佳助溶剂，另选几种乳化剂与选出的助溶剂滴定，结果比较得出最佳试剂组合，由此得出最佳茶多酚微乳剂配方。

2、微乳剂的稳定性研究

通过对该茶多酚微乳剂不断稀释来检测稀释是否有影响；取同浓度等量放置于不同温度环境条件下来研究温度影响；同样取同浓度等量放置于光照和黑暗条件下来研究光照是否影响其稳定性；通过将该微乳剂调至酸和碱的条件下看溶液是否变化来研究PH的影响。

3、不同浓度茶多酚微乳剂的抑菌效果研究

（1）、 将该茶多酚微乳剂稀释成不同浓度，分别混合至马铃薯培养基，在同等环境条件下培养苹果酵母菌，培养8天以后根据菌落直径的大小，并且与空白对照的菌落直径比较，通过计算得出抑菌率。

（2）、 将茶多酚微乳剂设置成不同的浓度，分别混合至马铃薯培养基，在同等适宜的条件下培养圣女果青霉菌，培养一定时间，制成细胞悬浮液，细胞悬浮液与不同浓度的茶多酚母液按9：1的比例定量混合（分别加入0.5ml相应茶多酚微乳剂母液和4.5ml的孢子悬浮液），以无菌水做CK对照。分别制成10.00mg/mL、 5.00mg/mL 、3.33mg/mL、 2.50mg/mL 和2.00mg/mL倍浓度的茶多酚细胞悬浮液，每处理重复三次。放于铺有湿纱布的陶瓷盒内（避免水分的蒸发）。置25℃恒温箱中培养1-2天（视对照的发芽情况而定）。观察不同浓度茶多酚微乳剂对圣女果青霉菌孢子萌发。

（3）、研究不同浓度茶多酚微乳剂对圣女果青霉菌细胞膜透性的影响，电导率仪需要预热30min后校准，每天于恒温震荡培养的各处理发酵培养液中各取10mL马铃薯液体培养液于试管中，直接读取电导率值。计算各个处理两天之间电导率的变化值并绘制表格。

（4）、研究不同浓度茶多酚微乳剂对圣女果青霉菌细胞内几种酶活性的作用，分别根据CAT酶活、SOD酶活的性质测定它们在不同时间下的活性，研究出不同浓度茶多酚微乳剂对圣女果青霉菌细胞酶活性的作用。

4、不同浓度茶多酚微乳剂的保鲜效果研究

1、茶多酚微乳剂对圣女果自然霉腐的影响

（1）实验方法：

将购买的圣女果整理，去有机械损伤的圣女果。选择新鲜度相似（用手感受硬度要相似）且大小差形态不多的圣女果360颗。用无菌水对360颗圣女果进行清洗，自然风干。将圣女果分成六组，每组20颗，对组别平行组进行编号标记。分别用2.00mg/mL、2.50mg/mL、3.33mg/mL、5.00mg/mL、10.00mg/mL五个浓度的茶多酚微乳剂以及自来水（对照组）实验重复三次。装入预先打孔（牙签穿洞2mm，共20排，每排20个孔）的相同型号的保鲜袋中，折口。每个袋子放20个圣女果，贴上标签。每隔一天（1、3、5、7、9......13天），观察圣女果的霉腐青黄，计算发病率。公式：

发病率（%）= 100%/

2、调查茶多酚微乳剂处理对圣女果失重率的影响

通过测量每组圣女果第一天的重量和第13天圣女果的重量，对不同浓度茶多酚微乳剂处理条件下圣女果的失重率进行计算，并绘制曲线图。公式：

失重率= 100%

3、调查茶多酚微乳剂处理对圣女果可滴定酸含量的影响

（1） 基本原理

圣女果中可滴定酸（titritable acidity，TA）含量测定的原理和一般果蔬中有机酸测定一样，即依据酸碱中和^[16]：用已知浓度的氢氧化钠溶液滴定圣女果匀浆提取液，氢氧化钠的消耗量与圣女果中的可滴定酸的含量呈正比。由于不同的果蔬中所含有的有机酸种类不同，并且每种果蔬中含有较多种类的有机酸，因此，根据所需测定果蔬中所含得主要类型的有机酸进行折算。圣女果中的主要有有机酸是苹果酸。

（2） 实验步骤：

A、试剂的配制

1、0.1mol/L氢氧化钠溶液

用蒸馏水（新煮沸过的）对用电子天平称取4.0g的分析用纯NaOH进行溶解，待冷却后，加蒸馏水（新煮沸过的）容量瓶定容至1000mL，倒入玻璃瓶（带塑料盖的）中，保存。配之邻苯二甲酸氢钾溶液（滴定液）来使用。准确用电子天平称取0.6000g基准邻苯二甲酸氢钾（在105℃干燥至恒重），加入50mL的水（新煮沸过放置冷却），振摇，尽可能的溶解它。之后加入2滴1%酚酞指示剂，再用配置的氢氧化钠溶液滴定。接近滴定终点时，使得邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至锥形瓶中溶液呈粉红色。NaOH滴定液的浓度：根据1mL的NaOH溶液的消耗量与邻苯二氢钾的消耗量计算。

2、1%酚酞指示剂

用100mL 50%的乙醇溶液来溶解电子天平称1.0g的酚酞粉末。

B、提取：吸取圣女果匀浆10.0mL汁液，倒入研钵中充分地磨碎，再置入到100mL容量瓶中，接着用蒸馏水把研钵冲洗液全部转入到容量瓶中，摇匀定容至刻度，摇匀。静置30min，接着过滤。

C、测定：吸取20.0mL滤液，转接入锥形瓶中，2滴1%酚酞指示剂被加入，滤液被已经标定的氢氧化钠溶液进行滴定。30秒内滴定至溶液初现粉色不褪色时为终点。记录实验组和CK组氢氧化钠滴定液的用量，平行组3组。pH约为8.2。

D、计算：氢氧化钠滴定消耗量可计算处计算圣女果中可滴定酸的含量，用质量分数(%)表示。

计算公式：

可滴定酸含量= ；

式中： V-----样品（圣女果）提取液总体积，mL;

V_s----滴定时所取滤液体积，mL;

C------NaOH滴定液浓度，mol/L;

V₁-----滴定过程中滤液消耗的NaOH溶液体积，mL;

V₀-----滴定过程中蒸馏水消耗的NaOH溶液体积，mL;

m-----样品质量，g;

f-------折算系数，g/mmoL，圣女果中的主要有机酸是苹果酸，f值取0.067

4、调查茶多酚微乳剂处理对圣女果维生素C的影响

抗坏血酸（ascorbic acid，ASA），便是大家熟悉的维生素C，对于人体的正常生命活动来说，维生素C至关重要，不可或缺，如果缺乏抗坏血酸，容易出现牙龈出血，甚至坏血病。圣女果中含有丰富的维生素C，因此，其含量受圣女果成熟度、贮藏条件、保鲜剂处理等条件的影响。测量维生素C含量，可以作为圣女果贮藏保鲜效果的重要评价指标之一。本设计采用2,6-二氯酚滴定法^[17]。

A、基本原理：

抗坏血酸不饱和多羟基化合物。坏血酸（2,6-dichloropHenol indopHenol）具有较强还原性是分子中的烯醇式结构造成的，因而能够使染料2,6-二氯酚靛酚（强具有氧化性）还原。计算出被测样品中抗坏血酸的含量：根据滴定时消耗的标准2,6-二氯酚靛酚溶液的量来计算。染料在酸性溶液中呈红色，在中性以及碱性溶液中呈现蓝色。作为还原剂时，自身被氧化为脱氢型抗坏血酸。因此，使用蓝色碱性2,6-二氯酚靛酚含有抗坏血酸草酸溶液滴定时，此时，也被氧化脱氢抗坏血酸和2,6-二氯酚靛酚可抗坏血酸还原化合物，此化合物无色。滴下的染料使草酸溶液因抗坏血酸完全被染料氧化立刻呈现浅粉红色。这一颜色转变用来指示滴定终点。

B、试剂的配制：

1、20g/L草酸溶液:称取20.0g草酸粉末，被蒸馏水充分溶解，再加蒸馏水稀释至1000mL。

2、浓度0.1mg/mL标准抗坏血酸（变成黄色的标准抗坏血酸不能用，只用白色的)，用已经配制好的浓度为20g/L的草酸溶液进行溶解，用容量瓶定容至500mL，使得1mL标准溶液中含0.1mg抗坏血酸。现用现配，可短期贮藏于棕色瓶中，低温4摄氏度保存。

3、2,6-二氯酚靛酚钠盐，溶于100mL的沸水中（含有26mg碳酸氢钠），充分摇溶，或冷却后置于冰箱中过夜，过滤，加蒸馏水稀释至1000mL。把溶液贮藏于棕色瓶中并置入冰箱保存。相隔大约一周重新配制，临用前用标准的抗坏血酸溶液标定。2,6-二氯酚靛酚溶液的标定：取10.0mL标准抗坏血酸溶液于锥形瓶中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定抗坏血酸至微红色，终点：15s不褪色，利用消耗的燃料的量计算出每1mL燃料溶液相抵的抗坏血酸质量，平行组三次，取平均值。

C、提取：

称取10g圣女果样品置于研钵中，用20g/L草酸溶液，在冰浴条件下研磨成浆糊状，倒入到100mL容量瓶中，用20g/L草酸溶液冲洗研钵，清洗液也全部倒入容量瓶中，把20g/L草酸溶液用容量瓶滴定至刻度，摇匀，提取10min后，过滤收集溶液备用。

D、用移液器吸取10.0mL圣女果滤液倒入100mL的锥形瓶，终点：用已标定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定滤液至出现微红色、15s不褪色。记下染料的用量。并且把10mL浓度为20g/L草酸溶液作为空白对照，按同样的方法进行滴定。重复三次。

E、圣女果中抗坏血酸含量由染料滴定消耗量来计算。单位表示：100g样品（圣女果鲜重）中含有的抗坏血酸的质量，单位符号mg/100g。计算公式:

抗坏血酸含量= 100（mg/100g）；

式中 ： V₁-----样品滴定消耗；

V₀-----空白对照滴定消耗的染料体积，mL；

ρ-----1mL染料溶液相当于圣女果中抗坏血酸的质量，mg/mL；

V_s-----滴定时所取圣女果样品溶液体积，mL；

V------样品提取液总体积，mL；

m------圣女果样品质量，g。