施氏假单胞菌海藻糖合酶的固定化研究开题报告

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1. 研究目的与意义

海藻糖合酶是生产海藻糖技术中的关键酶，可专一性地催化麦芽糖和海藻糖之间糖苷键的转化。海藻糖合酶属胞内酶，通常需先将细胞破碎，经逐级分离纯化后才可使用，酶活损失较大，且游离状态的酶只能一次性使用，由于其制备成本高，在实验室阶段尚可，但在工业化生产中使用会提高生产成本阻碍了其实际应用，制约工业化应用及海藻糖的大量生产。为解决制约大量生产海藻糖的问题，科学家们经过不断研究发现，将海藻糖合酶经过固定化后，固定化酶的稳定性大大提高。有助于解决海藻糖合酶实际应用时的问题。海藻糖合酶的固定化技术具有广阔的前景，这种技术不仅能稳定酶、改变酶的专一性、提高酶活力，改善酶的种种特性，使之更符合人类的要求。本实验采取介孔二氧化钛为固载，进行海藻糖合酶的固定化，为使海藻糖合酶达到最佳催化产酶效果，进行了优化酶浓度、载体浓度、转速、pH和温度、测定蛋白负载量、酶活回收率，找出最优固定化条件，使得海藻糖合酶固定化研究更进一步发展，同时发现固载二氧化钛可重复循环使用，固定化效果较好，使得海藻糖生产成本大幅降低，更适合工业化生产，高效率的生产将带来更大的经济效益。

2. 国内外研究现状分析

由于海藻糖具有独特的生物活性，各国科学家对其生产技术进行了大量的研究。虽然海藻糖的资源广泛，但是能够大量积累海藻糖的物种并不是很多，而且海藻糖是生物体对抗逆境的一种代谢应激物，一旦外部环境适宜，海藻糖又会迅速降解，给制备带来一定困难。目前正在研究和开发的海藻糖制备方法有化学合成法、微生物提取法、微生物发酵法、酶合成法、基因工程法。而且目前国内外正在研究不同固定化方法的联用，同时研究新型固定化材料和方法。

目前，大孔道、高比表面和孔容的新型介孔材料不断被引入酶固定化领域，因为大孔道、高比表面、高孔容的介孔材料中酶的负载量大，且酶的负载能快速完成，负载量高达580mg/g。分子筛作为载体材料已广泛应用于酶的固定化，介孔分子筛在生物酶的固定化、生物大分子分离、药物的传递和控制释放等方面的应用日益受到人们的重视。

尚宏丽等利用介孔分子筛mcm-41作为载体固定化海藻糖合成酶。并对固定化条件和固定化前后的海藻糖合酶性质进行比较研究。结果表明，海藻糖合成酶可通过物理吸附法固定于介孔分子筛mcm-41孔道中，在ph为3，给酶量为62．5 mg／g的条件下，固定12 h时可得到最佳固定化效果；与游离海藻糖合酶相比，固定化后的海藻糖合酶ph稳定性和热稳定性明显改善，并具可重复操作性，有利于酶的使用和储放。酶的固定化导致底物和酶亲和力的变化，表现为米氏常数发生变化。km的增加说明了固定化酶的亲和力降低了。游离酶由于无法从体系中分离，因此不具有可重复操作的性质。因此，以介孔分子筛mcm-41作为载体为海藻糖合酶固定化提供了一种新型的载体材料，有利于解决海藻糖合酶实际应用中的限制问题。该研究为开发新的固定化海藻糖合成酶提供了理论依据。

经过固定化的海藻糖合酶不仅仍具有高的催化效率和高度专一性，而且固定化酶提高了对酸碱和温度的稳定性，增加了酶的使用寿命；可简化工艺反应后易与反应产物分离，减少了产物分离纯化的困难，而提高了产量和质量。由于它具有上述优点，固定化海藻糖合酶已成为酶应用的一种主要形式。

3. 研究的基本内容与计划

（1） 建立实验必须的分析方法。（酶活的测定、蛋白浓度测定、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖的hplc测定）

（2） 施氏假单胞菌海藻糖合酶的固定化条件（优化酶浓度、载体浓度、转速、ph和温度、测定蛋白负载量、酶活回收率）

（3） 固定化载体和固定化酶的结构表征（sem、bet、ftir、cd）

4. 研究创新点

酶固定化过程中的新载体

实验利用介孔材料TiO₂作为酶固定化的新载体，利用大孔道有利于固定化与催化过程中酶蛋白和底物、产物的接触与传输，从而能提高酶的活力和催化效率，降低生产海藻糖的成本。